4.2.3 Técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa

4.2.3 Técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa

Estos ensayos identifican células malignas amplificando selectivamente una secuencia de ADN específica de un tipo de tumor. La única condición es conocer al menos dos secuencias génicas entre las que se localice el fragmento que deseamos amplificar.

La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una amplificación enzimática de ADN. Utilizando una enzima llamada ADN polimerasa obtenemos copias de una secuencia específica de ADN. Las ADN polimerasas son las enzimas que replican el ADN. La enzima que se utiliza en esta técnica tiene que ser termoestable y es obtenida de la bacteria Thermus aquaticus y se llama Taq polimerasa. Las ADN polimerasas necesitan un molde, cebadores y nucleótidos activados. El molde es una molécula de ADN de cadena sencilla. Los cebadores son pequeñas moléculas de ácido nucleico (de 15 a 20 nucleótidos) cuya secuencia es conocida y complementaria a los extremos 3’ de la secuencia que deseamos amplificar. Los cebadores se unen a sus secuencias complementarias, así flanquean la secuencia del ADN que queremos amplificar. Utilizando como anclaje el cebador apareado, la polimerasa iniciará la extensión de la cadena. Los nucleótidos activados son incorporados por la ADN polimerasa a la cadena naciente. Los nucleótidos activados son desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

La primera etapa de la reacción es la desnaturalización por calor de las moléculas de ADN, a continuación tiene lugar la etapa de anillamiento (consiste en la unión de los cebadores con la cadena molde) y por último la etapa de extensión. En cada ciclo se dobla la cantidad de ADN del ciclo anterior, según la fórmula 2ⁿ, donde " n" es el número de ciclos, permitiendo la obtención de muchas copias de la secuencia inicial (millones o billones de copias en unas pocas horas). La PCR se realiza en un termociclador programable, que controla el número de los ciclos, la exactitud a la que se producen las etapas y la cantidad de tiempo en el que se mantiene la reacción a las diferentes temperaturas.

Una variante de esta técnica es la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa. Se utiliza para la detección y amplificación de ARN, permite estudiar la expresión de determinados genes (su traducción a proteínas). Se extrae el ARN total de las células en estudio, a continuación se separa la fracción correspondiente al mensajero (ARNm) y por acción de una transcriptasa inversa se transcribe el ARN a ADN complementario (cADN).

Por cada molécula de ARNm se sintetiza una molécula de cADN monocatenaria y una ADN polimerasa la convierte en bicatenaria. En una etapa posterior se amplifica el cADN por PCR. Normalmente se utiliza la rTth ADN polimerasa de Thermus thermophilus, que es una enzima recombinante y termoestable que actúa como transcriptasa inversa y como ADN polimerasa. Para saber si se ha amplificado la cadena de ADN de interés se suele utilizar la electroforesis en un gel teñido con bromuro de etidio. Este compuesto se intercala en las bases del ADN provocando una alta densidad electrónica. Al exponer el gel a luz ultravioleta los electrones del bromuro de etidio se estimulan produciendo fluorescencia, pudiéndose así visualizar el ADN. Las bandas gruesas que observamos en el gel son las secuencias de ADN que hemos amplificado. Conocemos su tamaño porque en un pocillo del gel se añade una mezcla de fragmentos de ADN de tamaño conocido. Según la altura a la que haya migrado el ADN amplificado tendrá un tamaño u otro.

Para estudiar la EMR podemos utilizar como marcadores moleculares dianas localizadas tanto en el ADN como en el ARN.

En el ADN podemos utilizar varios marcadores:

Los dos últimos marcadores tienen un valor limitado en el estudio del cáncer porque pueden detectarse en lesiones premalignas o en tejidos no neoplásicos (Nathan et al., 1999).

Como dianas en el RNA se pueden usar:

La PCR es una metodología con una gran sensibilidad que detecta una célula tumoral de entre 10⁶ a 10⁷ células normales. Es una técnica rápida que además puede realizarse con una pequeña cantidad de muestra.

Sin embargo, presenta algunas limitaciones. Debido a su gran sensibilidad, uno de los principales problemas es el riesgo de contaminación con ADN extraño, porque se pueden amplificar fragmentos de este último (Catasús et al., 1997),es decir, que una posible contaminación puede causar falsos positivos. Los métodos basados en dianas de ARN se contaminan con mayor facilidad. Otro problema es la pérdida de sensibilidad cuando se emplean como marcadores moleculares reordenamientos de los genes de las inmunoglobulinas porque pueden sufrir muchas mutaciones que impiden la correcta hibridación de los cebadores y de sondas específicas. La solución consistiría en sintetizar sondas y primers específicos de cada paciente, pero esto encarecería el análisis y la laboriosidad del mismo. Un gran inconveniente es la evolución de los clones leucémicos, la formación de subclones y/o la presencia de poblaciones oligoclonales que pueden causar resultados tanto falsos negativos como falsos positivos. La oligoclonalidad de los reordenamientos de los genes de las inmunoglobulinas y TCR en el momento del diagnóstico es un fenómeno relativamente frecuente. Si ocurriesen reordenamientos primarios y secundarios durante el curso de la enfermedad, podrían producir la pérdida de la especificidad de las regiones unidas inicialmente e identificadas en el momento del diagnóstico, por lo que se recomienda, para evitar falsos positivos o falsos negativos durante su seguimiento, monitorizar a los pacientes con LLA con 2 ó más dianas de PCR independientes. Debido a la evolución clonal un subclon genético podría desarrollarse como una constitución genética distinta del primer clon de leucemia. Este clon podría multiplicarse provocando una recaída leucémica porque no podría ser detectado con los cebadores y sondas utilizadas para detectar el primer clon (Campanaet al., 2003).Otro problema es la facilidad con la que se puede degradar el ARN y la ineficiente conversión de ARNm a cADN. Además, es una técnica cualitativa, es decir, sólo indica presencia o ausencia de la secuencia específica del ADN. Esto es una limitación a la hora de monitorizar la EMR.

Para solventar el último problema expuesto se han desarrollado nuevas técnicas. El producto de la PCR se puede cuantificar realizando una RT-PCR junto con un ensayo inmunoabsorbente enzimático (ELISA) posterior o la técnica de PCR a tiempo real.

Si cuantificamos la amplificación de la PCR con RT-PCR y ELISA necesitamos productos de PCR biotinilados, que se generan utilizando un cebador biotilinado. Estos productos son inmovilizados en los pocillos de placas de microaglutinación recubiertas por avidina, que se une fuertemente a la biotina. Los productos de PCR específicos son detectados por hibridación con una sonda específica marcada con "digoxigenin". Para visualizar su unión se realiza un ELISA, el anticuerpo empleado es un anticuerpo "antidigoxigenin" conjugado con un enzima.

La técnica de la PCR a tiempo real (QF-PCR) ha resuelto el problema de la cuantificación del producto de la PCR. En un mismo tubo se amplifica la secuencia de ADN de interés y se cuantifican. Se emplean agentes fluorescentes que se intercalan en el ADN o sondas específicas de hibridación marcados con fluorocromos para detectar y cuantificar los productos amplificados. Los termocicladores donde tienen lugar la QF-PCR tienen un lector de fluorescencia que puede medir en todo momento la fluorescencia de cada uno de los viales donde se realiza la reacción. La fluorescencia que emite la reacción es proporcional a la concentración de ADN sintetizado, de este modo podemos conocer en todo momento la cantidad de ADN sintetizado. Ésta es la gran ventaja respecto a los métodos convencionales de PCR en los que sólo se puede cuantificar el producto amplificado al final de la reacción, y en ese momento la mayoría de las reacciones han alcanzado la fase de saturación. La concentración que se mide en ese momento no se correlaciona bien con la concentración inicial de la muestra.

La RT-PCR está adquiriendo mayor importancia en el estudio de la EMR por su capacidad de cuantificar, porque la variación de la EMR a lo largo del tiempo tiene una gran valor en el seguimiento y actitud terapéutica de muchos pacientes con leucemias (Tomás et al., 2004). Además, la QF-PCR tiene otras ventajas respecto a la PCR convencional. Como no requiere la manipulación post-PCR su probabilidad de contaminación es más baja, con lo que disminuyen los falsos positivos. Es más sensible, es más exacta, más rápida y más sencilla. Sin embargo, los fluorocromos utilizados se unen a cualquier ADN de doble cadena de forma inespecífica (dímero de primers y/o productos inespecíficos).

Actualmente poco estudios demuestran que esta técnica tenga una relevancia pronóstica. Una posible explicación es la falta de una estandarización precisa de la técnica que dificulta una mayor comparabilidad interlaboratorio. Hay varias razones técnicas que lo explican: la sensibilidad y especificidad de estos ensayos están muy influenciadas por pequeñas modificaciones en cada paso como la toma y procesamiento de la muestra, protocolos de separación celular, métodos de extracción del ARN y/o ADN, tipo de reacción de la transcriptasa inversa, selección de las dianas, diseño de los cebadores o condiciones de la PCR. Otra razón es la facilidad de contaminación del producto amplificado. Es necesario un estricto control de calidad para poder evitar falsos positivos. Además, tiene una baja reproducibilidad cuando hay poco número de transcritos.

Sensibilidad de las técnicas de detección de EMR