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Bases genómicas de respuesta oncológica a la irradiación
Enfermedad Mínima Residual
4. Métodos De Determinación De La Enfermedad Mínima Residual
4.2 Técnicas de biología molecular

4.2.2 Hibridación ''in situ'' fluorescente (FISH)

4.2.2     Hibridación "in situ" fluorescente (FISH)

Es una técnica molecular que permite localizar un determinado fragmento de la secuencia de los ácidos nucleicos y pone de manifiesto la presencia o ausencia de secuencias génicas específicas. Se puede aplicar sobre núcleos interfásicos de extensiones celulares o cortes de tejido o directamente en cromosomas. La posibilidad de poder utilizar las técnicas de FISH sobre células que no están dividiéndose es importante en aquellas neoplasias con baja tasa de división celular, como en los síndromes linfoproliferativos crónicos. Para ello utiliza sondas marcadas con fluorocromos. Dependiendo del tipo de sonda utilizada es posible evaluar la presencia de reordenamientos en los núcleos.

Las sondas son pequeñas secuencias de cadena sencilla de ADN, complementarias a la secuencia de interés del ácido nucleico.

Podemos utilizar distintos tipos de sondas:

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Centroméricas o ADN satélite: estas sondas hibridan con las regiones α o β satélites u otras secuencias repetitivas de la región centromérica del cromosoma. Son de utilidad para detectar alteraciones cromosómicas numéricas. Como hemos dicho anteriormente, esta técnica puede aplicarse sobre células en división o núcleos interfásicos, por tanto podemos detectar anomalías cromosómicas numéricas sin necesidad de tener células en metafase.
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Las sondas de pintado cromosómico contienen una librería de secuencias genómicas que abarcan todo un cromosoma o una determinada región. Con estas sondas podemos detectar alteraciones estructurales o numéricas de los cromosomas, pero sólo en células en metafase. Es muy útil cuando tenemos cromosomas de mala calidad.
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Las sondas de secuencia única (locus específico), hibridan con secuencias cromosómicas muy concretas, correspondiente a una banda cromosómica o a un gen. Con estas sondas podemos visualizar alteraciones estructurales o numéricas tanto en núcleos en interfase como en metafase. Podemos detectar la presencia de células tumorales residuales con una anomalía característica de estirpe o subtipo, como la t(9;22) en la leucemia mieloide crónica, la t(15;17) que afecta al PML/RARα en la leucemia mieloide aguda.

Su sensibilidad varía desde 10-2 a 10-5 (detecta una célula tumoral entre 100 a 100.000 células normales) dependiendo del tipo y la cantidad de la sonda utilizada (Kasprzy et al., 1997). Si aplicamos sondas centroméricas para el estudio de trisomías tendremos una sensibilidad del 1%, cuando coexisten 2 ó 3 trisomías se podría detectar una célula neoplásica de entre 104 a 106 células normales, porque se multiplican los puntos de señal en una misma célula. Cuando aplicamos las sondas para detectar translocaciones específicas, utilizamos sondas que comprenden los fragmentos del ADN de los genes implicados en la tranlocación, por ejemplo BCR-ABL, PML-RAR, con este tipo de sondas obtenemos una sensibilidad de 10-1. Sin embargo, cuando utilizamos las translocaciones como marcadores para detectar células tumorales es más sensible la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa.

Para localizar las secuencias de interés, la sonda debe hibridar con la secuencia de ADN de la muestra. El primer paso consiste en desnaturalizar las moléculas de ADN (separar las hebras complementarias de la estructura en doble hélice del ADN), tanto la de la sonda como la de la muestra de estudio. Para ello elevamos la temperatura hasta 70 ºC - 80 ºC, o variamos

el pH, y de este modo se rompen los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas del ADN. Después se hibrida la sonda con su región complementraria del ADN de la muestra, se incuban a 37 ºC la sonda de interés con la muestra, y por complementariedad de las bases se une la sonda de interés con la región complementaria del ADN de la muestra. Con un microscopio de fluorescencia se observan las señales de la sonda.

Esta metodología es útil para cuantificar aberraciones numéricas, tanto si se presentan o no en clones de baja expresión o baja capacidad proliferativa y para monitorizar clones hiperdoploides en leucemia linfoblástica aguda. Otra aplicación de la FISH es en el seguimiento de pacientes con un transplante alogénico de distinto sexo. Así, si utilizamos sondas centroméricas para los cromosomas sexuales, tendremos una información rápida del porcentaje de células del donante y células residuales del receptor.

La FISH, como complemento de la citogenética convencional, puede ser de utilidad diagnóstica y pronóstica en el estudio de las neoplasias hematológicas.

Ambas metodologías tienen limitaciones y ventajas. La citogenética requiere que las células del clon neoplásico se estén dividiendo. Cuando los cromosomas son de mala calidad su interpretación es dudosa. Se analizan pocas células y tiene una baja sensibilidad. Por el contrario la FISH se puede utilizar sobre núcleos en interfase y sobre células en metafase, pudiendo analizarse más células que con la citogenética, siendo además una técnica con mayor sensibilidad. La información que nos aporta la técnica de FISH está limitada al reordenamiento buscado, es decir a la sonda utilizada. Sin embargo, con la citogenética tenemos información de todos los cromosomas. La técnica de FISH tiene un mayor coste que la citogenética.