4.2 Estudios de apoptosis radioinducida en subpoblaciones linfocitarias por citometría de flujo

4.2      Estudios de apoptosis radioinducida en subpoblaciones linfocitarias por citometría de flujo

El estudio de la radiosensibilidad de las distintas subpoblaciones linfocitarias (CD4, CD8, B, NK) nos podría ayudar a determinar qué población linfocitaria sería más útil para un test predictivo de uso clínico habitual pre-radioterapia. Se han realizado varios estudios sobre el efecto de la radiación ionizante en las distintas subpoblaciones de linfocitos de sangre periférica, aunque sin llegar a resultados concluyentes.

Stewart et al. (1988) utilizaron un sistema de cultivo y medida por citometría de flujo para evaluar la radiosensibilidad de los linfocitos TCD4+,CD8+ y linfocitos B obtenidos de controles sanos. Los linfocitos CD8+ eran dos veces más radiosensibles que los TCD4+ y los linfocitos B tenían una radiosensibilidad intermedia.

Los estudios de Ozsahin et al. (1997) y Crompton et al. (1999) mostraban que dentro de controles sanos e individuos con enfermedades genéticas, se producían claras diferencias entre la radiosensibilidad de las subpoblaciones linfocitarias TCD4+ y TCD8+.

Rana et al., (1990) analizaron la sensibilidad de las células natural killer (NK) después de la exposición a diferentes dosis de radiación gamma. Las PBLs se irradiaron conjuntamente a bajas (2-6Gy) y altas dosis (10-30Gy) de radiación y se analizaron después de las 3 y 48 horas de incubación. Después de las 48 horas postirradiación, se observaba un descenso en la actividad citotóxica de las PBLs mientras que la actividad lítica de las NK aumentaba. Las células NK tenían actividad citotóxica a bajas dosis. Sin embargo, a altas dosis se producía una pérdida de actividad. Por tanto, la radiación ionizante se encargaba de seleccionar aquellas subpoblaciones de células NK más citotóxicas o estimulaba la actividad citotóxica en células supervivientes.

Seki et al. (1995) estudiaron el posible efecto protector de varias citoquinas en la apoptosis radioinducida de subpoblaciones linfocitarias. La exposición a la irradiación gamma producía cambios apoptóticos en todas las subpoblaciones linfocitarias. Las células NK eran las más radiosensibles, mientras que los linfocitos T CD8+ y B mostraban una débil susceptibilidad a la radiación y los TCD4+ eran relativamente radioresistentes. La apoptosis inducida por radiación de los linfocitos NK y B, estaba inhibida por IL-2 y IL-4 respectivamente y la de TCD4+ y TCD8+ por IL-2, IL-4, IL-7. Además, el efecto protector

de cada citoquina en la apoptosis radioinducida podría estar parcialmente atribuido al aumento de expresión de la proteína BCL-2 (Seki et al., 1995).

Ozsahin et al. (1997) analizaron la apoptosis radioinducida a los 2 y 8 Gy para los linfocitos T CD4+ y CD8+ de 45 donantes sanos. Se observó una buena correlación entre la apoptosis a los 2 y 8 Gy, tanto para los TCD4+ como para los CD8+(r=0.77) sin embargo, se observaron correlaciones inferiores cuando se relacionaba la apoptosis entre ambos tipos celulares (r=0.63 para los 2 Gy y r= 0.65 para los 8 Gy). Esto sugiere que la muerte celular inducida dependía del tipo celular. La radiosensibilidad absoluta era también diferente entre los linfocitos T siendo los TCD8+ más radiosensibles que los TCD4+.

Tabla 2. Radiosensibilidad de las distintas subpoblaciones linfocitarias

Crompton et al. (1997) en 12 donantes sanos a dosis de 0, 2, 8 Gy y 24 horas de incubación, representaron el porcentaje de citotoxicidad radioinducida en 6 tipos celulares diferentes, observándose que las células más sensibles a la citotoxicidad radioinducida eran los linfocitos T CD8+, seguido de los linfocitos B, NK, T CD4 +, granulocitos y monocitos. Todos los tipos celulares, excepto los monocitos, mostraron un claro aumento dosis dependiente en citotoxicidad.

Philippé et al. (1997) realizaron el estudio en 6 donantes sanos a 2 Gy de dosis y analizaron los resultados a las 24 horas de irradiación con Annexina V por citometría de flujo. Observaron que las células NK eran las más resistentes y que las B eran las más sensibles y que entre los linfocitos T, los CD4+ y CD45 RA- eran más susceptibles a la apoptosis que los CD8+ y CD45RA+. Por otro lado, se observó que la apoptosis espontánea correlacionaba con la diferente radiosensibilidad a la apoptosis entre las subpoblaciones. Además, se observó una relación con la vida media de los linfocitos ”in vivo”. Así, poblaciones linfocitarias con una corta vida media in vivo eran más susceptibles a la apoptosis “in vitro” y viceversa.

En un estudio más extenso, Schmitz et al. (2003) analizaron 63 donantes sanos a dosis de 0,0.5, 1, 2 Gy a intervalos de 2 horas (8h-22h) utilizando Annexina V y Hoechst 33258 (marcador fluorescente que permite discriminar células necróticas) observándose, como en estudios anteriores, que dentro de los linfocitos T, los CD3+CD4+ eran más resistentes que los CD3+CD8+ y que los linfocitos B eran los más sensibles. La apoptosis espontánea y apoptosis radioinducida estaban correlacionadas en todos los tipos celulares. Las radiosensibilidad de los linfocitos T CD3+CD4+ y CD3+CD8+ estaban estrechamente correlacionadas y ninguno de ellos se correlacionaba con la radiosensibilidad de los linfocitos B.

A pesar de estos estudios, las bases moleculares de la diferente radiosensibilidad a la radiación ionizante permanecen sin esclarecer. Así, Seki et al., (1994) mediante el análisis por Western Blot de la proteína p53 de distintas subpoblaciones linfocitarias, observó una inducción por irradiación de la proteína en células TCD4+, TCD8+ y células B. Sin embargo, no se identificó ninguna banda en células NK irradiadas. Estos resultados sugieren que la síntesis de novo de algunas proteínas, incluyendo p53, es requerida para la apoptosis radioinducida en células T, mientras que otros mecanismos independientes de p53 pueden estar operando en la iniciación de la apoptosis en células NK irradiadas.

Por otro lado, Muller et al. (1998) analizaron por Western Blot el complejo DNA-PK que participa en la reparación de roturas dobles de cadena (dsb) en células de mamífero. El análisis reveló que las células B expresaban una forma variante de la proteína Ku-86 con un aparente peso molecular de 69 kDA y no la proteína de 86KDA. Esta forma alterada del heterodímero Ku tiene una capacidad menor para reclutar el componente catalítico del complejo DNA-PKcs, el cual contribuye a una ausencia de actividad DNA-PK detectable en células B. Estos datos proporcionan unas bases moleculares para la explicar la sensibilidad incrementada de las células B ante las radiaciones ionizantes.

En un reciente estudio, Mori et al., (2005) utilizando RT-PCR cuantitativa, demostraron que los niveles de expresión de Bax aumentaban en linfocitos en correlación con la sensibilidad de las células (NKCD56+<TCD4+<TCD8+<BCD19+), lo cual refleja su radiosensibilidad diferencial para el efecto de la muerte por radiación. En contraste, los niveles de expresión de otro gen proapoptótico, TNFRSF10B, en células irradiadas no se diferenciaba significativamente entre las distintas subpoblaciones, sugiriendo que su expresión no podía relacionarse con la radiosensibilidad diferencial de los subtipos celulares.

Estos resultados sugieren que la apoptosis radioinducida en linfocitos es disparada por al menos dos rutas dependientes de p53. La primera, a través de Bax, induce la muerte celular actuando en la mitocondria, e influye por tanto en la radiosensibilidad diferencial entre las subpoblaciones celulares y la segunda, a través de TNFRSF10B, el cual media la apoptosis, actuando a nivel de membrana plasmática vía interacción con su ligando TRAIL.