4.1 Estudios de apoptosis radioinducida en linfocitos por citometría de flujo

4.1      Estudios de apoptosis radioinducida en linfocitos por citometría de flujo

La técnica de análisis de la apoptosis radioinducida en linfocitos de sangre periférica (PBLs) por citometría de flujo se desarrolló en un intento de acelerar la obtención de resultados para el desarrollo de un test predictivo factible y útil en la práctica clínica rutinaria (Ozsahin et al., 1997; Crompton et al., 1999, 2001; Barber et al., 2000).

En la mayoría de los trabajos publicados, salvo en el estudio de Barber et al. (2000), se ha demostrado una correlación entre la tasa de apoptosis radioinducida y la toxicidad del paciente.

En el estudio de Ozsahin et al. (1997) se analizó la apoptosis radioinducida en 45 donantes sanos y 5 pacientes con distintas anormalidades genéticas, observándose que los linfocitos CD4 de un paciente con ICF (síndrome de anormalidades facial) tenían una baja apoptosis radioinducida, al igual que para un paciente con Ataxia Telangiectasia (AT), tanto en los linfocitos CD4 como CD8.

Alguna de las características de la técnica fueron: 1) Utilización de sangre completa heparinizada con lisis posterior de eritrocitos, 2) ADN marcado con DAPI, 3) Análisis a las 24 horas de incubación, 4) Dosis de 0, 2, 8 Gy, 5) Apoptosis determinada mediante la degradación del ADN que producía una población adicional de células con valores ADN

sub-G1 a la izquierda del pico G1/G0.

Crompton et al. (1999) analizaron la apoptosis en linfocitos CD4 y CD8 en 12 pacientes con cáncer que presentaban una alta toxicidad a la radioterapia y 9 pacientes con AT, observándose en los 12 pacientes hipersensibles menos apoptosis radioinducida que los controles sanos. Los pacientes con AT desarrollaban incluso menos apoptosis que los pacientes hipersensibles. El porcentaje de la respuesta apoptótica de los linfocitos TCD8 de los individuos radiosensibles estaba por debajo del porcentaje de apoptosis de los individuos que respondían de forma normal.

En un estudio posterior se llega a la conclusión de que son cuatro las fuentes fisiológicas de la variación en la respuesta a la radiación: dos genéticas, como son la hipersensibilidad y enfermedad hereditaria y dos epigenéticas, como son el tipo celular y la edad del paciente (Crompton et al., 2001). Algunas de las características del experimento fueron: 1) Utilización de sangre heparinizada con lisis de eritocitos, 2) ADN marcado con IP, 3) Análisis a las 48 horas de incubación, 4) Dosis de 0, 2, 9 Gy 5) Apoptosis fue confirmada por microscopía y por kits de detección de apoptosis (in situ nick translation y Annexin V).

Tabla 1. Relación apoptosis radioinducida con toxicidad

Barber et al. (2000), compararon pacientes homo y heterocigotos para la AT y pacientes con cáncer de mama con toxicidad tardía incrementada frente a donantes sanos y pacientes tratadas por cáncer de mama con toxicidad tardía normal sin encontrar relación apoptosis-toxicidad (no se observó correlación entre la apoptosis y severidad de la fibrosis mamaria, retracción o telangiectasia). Sin embargo, se observó una peor inducción de apoptosis radioinducida en pacientes homocigotos para AT y un nivel reducido en heterocigotos para AT comparado con individuos normales. También se observaron bajos niveles en pacientes con cáncer de mama comparado con individuos normales. Algunas de las características de la técnica fueron:1) Aislamiento de PBLs de sangre completa, 2) Determinación tras 24horas de incubación, 3) Utilización de un único punto de dosis (4 Gy), 4) estimación de apoptosis mediante ensayo TUNEL.

En un estudio reciente realizado por Ozhasin et al. (2005) se correlacionó la modificación de la tasa de apoptosis radioinducida de cada subpoblación linfocitaria con la toxicidad de 399 pacientes con distintos tipos de cáncer. Se observó que la apoptosis radioinducida de linfocitos T predecían significativamente los efectos tardíos de grado 2 y grado 3 (p< 0.0001). Los pacientes con efectos tardíos de grado 3 mostraron una apoptosis radioinducida en TCD4+ CD8+ por debajo de la media (p< 0.0001) siendo los linfocitos TCD8+ más sensibles y más específicos que la apoptosis de los linfocitos TCD4+ en el análisis multivariante. No se encontró asociación entre la toxicidad temprana y la apoptosis de los linfocitos T radioinducidos o entre la toxicidad temprana y tardía.