5.4 Ensayos In Vivo Con Ratones

5.4         Ensayos In Vivo Con Ratones

Por un lado se utilizan ratones (Swiss macho) para determinar la toxicidad del producto. Esto se realiza inoculando en los ratones diferentes dosis de los compuestos para determinar los posibles efectos tóxicos respecto al control, al cual solamente se le ha añadido cloruro sódico. En todos los casos se ha visto que los productos son bastante tolerables (Tabla 6) (Hernández-Alcoceda y col., 1999).

Los otros ensayos in vivo se han hecho realizando xenagrafos, es decir en ratones inmuno-deprimidos se induce la formación de un tumor, en este caso solamente se ha utilizado la línea HT-29. Cuando el tumor se puede determinar a simple vista (1 cm³) se comienza a tratar con los diferentes compuestos y a diferentes dosis, aunque a esta fase solamente han llegado dos productos, los resultados obtenidos en ambos casos han sido muy prometedores. Se ha podido comprobar que, después de repetidas dosis, el tumor decrecía en tamaño y la esperanza de vida de los ratones aumentaba considerablemente, hasta 125 % respecto al control sin tratamiento (Hernandez-Alcoceda y col., 1999).

Ensayos más específicos, parten de que en tumores con los oncogenes ras transformados existe un incremento de actividad de la ChoK y un aumento del contenido de PCho que actúa como segundo mensajero en el proceso de división celular.

Figura 7: Descripción de la capacidad de reducción del tumor

          utilizando el compuesto MN52B, A (5mg/Kg) y B (3mg/kg)

          de compuesto. (Hernandez-Alcoceda y col., 1999).

Para confirmar estos supuestos, se hacen diferentes ensayos in vitro, con varias líneas celulares, un control NIH 3T3, esta misma línea transformada en N, H y K-ras, (Ramirez de Molina y col., 2001) y otras líneas transformadas en srcy v-fos (Rodríguez-González y col., 2003). En estas cuatro líneas se realizan análisis de la actividad de ChoK, se completa este análisis determinando la producción de PCho y la capacidad de captar colina del medio, además de determinar la actividad de la PLD (fosfolipasa D) que se resuelve por cromatografía de capa fina. Para el resto de ensayos se ha utilizado colina marcada (Ramirez de Molina y col., 2001).

Figura 8: Análisis de la actividad de ChoK y PLD en las líneas NIH 3T3 transformadas en N, H y K-ras,

           antes de comenzar a utilizar los ensayos con MN58B en estas líneas (Ramirez de Molina y col., 2001).

Una vez confirmado que en las líneas transformadas existe una mayor actividad de la ChoK y por tanto una mayor producción y acumulación de PCho, así como que la captación de la colina del medio es independiente de la actividad desarrollada por ChoK, se utiliza sobre estas líneas el producto MN58B comprobando que son más sensibles al fármaco que otras líneas tumorales no especíificas del oncogen ras transformado (Ramirez de Molina y col., 2001; Rodriguez-González A y col., 2003).

Análisis posteriores de este fármaco aseguran su efectividad en células tumorales y su inocuidad sobre células normales. Describiendo brevemente la metodología utilizada; se analizó la actividad antiproliferativa en células tumorales y en células normales, linfocitos mas concretamente, determinando que parte del ciclo celular se veía afectado. Se pudo comprobar que en células normales el fármaco induce un arresto celular en fase G₀/G₁ y que revierten al ciclo una vez desaparece el fármaco, mientras que en células tumorales induce apoptosis directamente por un mecanismo dependiente de la producción de ceramidas. Mediante Western blot se analizó que otras rutas podían estar afectadas por la inhibición de ChoK, comprobando satisfactoriamente que no hay rutas cercanas que se vean afectadas, ni alteraciones en lípidos de la membrana (Rodriguez-Gonzalez y col., 2004).

Figura 9: Efectos del tratamiento Con MN58B sobre linfocitos primarios, a; análisis del ciclo celular por citometria de flujo. b; Tiempo de fosforilación de pRb mediante Western blot en células normales (-) y tratadas con MN58B (+). c; niveles totales de p21, p53 y p57 en células normales (-) y tratadas con MN58B (+). d; niveles totales de CDK-2 y de CDK-2 fosforilada en células normales (-) y tratadas con MN58B (+) (Rodriguez-Gonzalez y col., 2004).

Figura 10: Inhibición de ChoK induce apoptosis en células Jurkat. a; células analizadas por citometría de flujo. Analisis mediante Western blot, donde (-) células no tratadas y (+)tratadas con MN58B,: b; determinación de la integridad de PARP, c; análisis de la fosforilación de pRb, d; integridad de la procaspasa 9 y e; niveles de p53 (Rodriguez-Gonzalez y col., 2004).