5.2 Determinación De Niveles Intracelulares De Pcho

5.2       Determinación De Niveles Intracelulares De Pcho

Para este análisis se utiliza cloruro de [¹⁴C-metil] colina. Las diferentes

líneas celulares se incuban en un medio adecuado que contiene los distintos compuestos inhibidores (fármacos derivados de HC-3), a diferentes concentraciones, y con la colina marcada a (50-60 Ci/mmol). Después de un periodo de incubación se recuperan las células, se tratan y finalmente las muestras tratadas se resuelven en cromatografía de capa fina. La radioactividad correspondiente a la PCho se cuantifica en un contador de centelleo y se puede establecer una dosis-respuesta de la actividad inhibitoria de los productos analizados y determinar su IC₅₀.

El grupo de Prof. Lacal, en diferentes análisis sobre actividad, destaca la baja concentración a la que son capaces de actuar algunos de los productos. Algunos de estos productos pueden llegar a inhibir la concentración de PCho hasta 2500 veces mas que el HC-3 (Lacal , 2001; Hernandez-Alcoceda y col., 1999).

Además se puede ver que estos derivados del HC-3 no afectan a otras rutas de señalización mitogénicas como (MAPK, MAPK/ERK, etc.).

Figura 5: Determinación de formación de PCho marcada, utilizando la línea

          NIH 3T3, en presencia(○)y ausencia (●) de agentes mitogenicos (▲) y en presencia

           de de HC3 y HC3 + agentes mitogénicos, (Karan y col., 1998).